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CLOROFILLE

Le clorofille  sono i pigmenti più abbondanti in natura, e le si trova in più di 100 diverse strutture; sono le responsabili del colore verde degli organismi fotosintetici ossigenati come le piante, le alghe, le microalghe e in alcuni batteri. Il loro ruolo primario è sicuramente quello della fotosintesi clorofilliana.

Ad oggi si conoscono sette tipi di clorofille:

–  Clorofilla a _ tutte le piante, alghe, alghe verdi blu, batteri proclorofati;

–  Clorofilla b_ tutte le piante, alghe verdi, euglenophyta, proclorofati  batterica;

–  Clorofilla c1, c2, c3_ alghe brune, dinoflagellati, diatomee e altri gruppi di alghe;

–  Clorofilla d_ alcune alghe rosse e altri gruppi di alghe;

–  Clorofilla f_ alcune alghe verde-giallo.

Le clorofille a, b e c sono state riportate nel diciannovesimo secolo, la clorofilla d è stata identificata più di 70 anni dopo mentre la clorofilla f è scoperta più recente; tuttavia le principali clorofille usate come fonte per i coloranti alimentari (E140-E141) sono la clorofilla a e la clorofilla b, peraltro le sole clorofille contenute nelle piante superiori. La clorofilla c, contenuta nelle alghe, microalghe e nei cianobatteri, nonostante sia indicata in letteratura come più stabile delle clorofille a e b, a causa della difficoltà di estrazione e purificazione (gli estratti sono contaminati da alti livelli di ioni metallici), di fatto non ha ancora reso fattibile la possibilità di ottenere clorofille commerciali derivate da queste fonti.

 

CLOROFILLE NEI VEGETALI

Nei vegetali, sono contenute solo clorofille a e clorofille b. La loro quantità totale e il rapporto tra il tipo a e il tipo b, è molto variabile anche all’interno della stessa specie vegetale, in quanto dipende da tantissimi fattori; tra i più importanti, troviamo:

–  il grado di maturazione;

–  il grado di senescenza;

–  la regione geografica di origine;

–  il clima;

–  il metodo di coltivazione;

–  la stagione del raccolto.

In ogni modo,  il rapporto tra la clorofilla a e quella b, è indicativamente di 3:1, anche se può arrivare fino a 1:1. dove il fattore determinante sembra essere la quantità di tempo che il vegetale rimane esposto alla luce solare durante il suo sviluppo. Le clorofille, soprattutto per le loro proprietà salutistiche, sono uno dei pigmenti più studiati; ma purtroppo a causa della loro instabilità durante l’estrazione e durante la purificazione, non ci sono, se non per pochi  vegetali, dati analitici precisi e affidabili sui loro contenuti di clorofilla totale e delle singole clorofille a e b.

Gli spinaci, i cavoli e il prezzomolo, sembrano essere le verdure a foglia più ricche di clorofilla, e arrivano ad averne fino all’1,5-2,0% del loro peso fresco. Le clorofille sono distribuite all’interno dei vegetali, in ogni sua parte esposta alla luce, anche se la loro quantità è notevolmente maggiore nelle foglie rispetto agli steli. Nelle foglie, il contenuto è variabile tra i 60 e i 200mg, mentre negli steli arriva al massimo a 8mg per 100gr di prodotto fresco.

Per la produzione di clorofille commerciali E140 ed E141, come indicato anche sui requisiti di purezza (Reg. 231/2011), vengono utilizzate, erba, erba medica (Medicago sativa, conosciuta anche come alfalfa e lucerne), e ortica (Urtica dioica). La scelta della materia prima per i coloranti alimentari, tiene conto di vari fattori :

–  la convenienza della raccolta;

–  la facilità di estrazione del pigmento;

–  la resa degli estratti;

–  il valore dei sottoprodotti di scarto riutilizzabili come mangime per gli animali.

Le clorofille in natura, rappresentano il pigmento più importante per la fotosintesi clorofilliana, il loro ruolo primario è catturare l’energia presente nella luce solare e trasformarla in energia chimica, sono strutturare per farlo, ma allora perché quando vengono utilizzate come coloranti alimentari, presentano così tanti limiti applicativi, dovuti principalmente alla loro instabilità alla luce, al pH e al calore ? Come avviene per altri pigmenti di origine naturale, anche per le clorofille, conoscere a fondo il loro ambiente naturale, come sono inserite in esso e come si comportano nelle loro fasi naturali, è fondamentale per rispondere a questa domanda.

Dopotutto le clorofille e il loro ruolo nella fotosintesi clorofilliana hanno almeno 3500 milioni di anni e, se non per qualche dettaglio, probabilmente non è mai cambiata in modo significativo continuando a sostenere la nostra vita sulla terra, ditemi se è poco, e se non può insegnarci e farci comprendere qualcosa !

CLOROFILLE NELLE ALGHE

Le alghe e i cianobatteri nonostante siano organismi molto più semplici, sono fotosintetici. Come per le piante vegetali contengono le clorofille, così suddivise:

CLOROFILLA a_ si presenta universalmente in tutte le alghe.

CLOROFILLA b_  è presente solo nelle alghe verdi (Chlorophyta) ed Euglenophyta;

CLOROFILLA c_è ampiamente distribuita e abbondante nelle alghe cromofite e diatomee, e di solito consiste in una miscela di due componenti c1 e c2. La  clorofilla c, compresi  i suoi due i componenti (Chl c1 e Chl c2) differiscono dalle clorofille a e b in diversi aspetti importanti: sono porfirine piuttosto che derivati del cloro con anello IV insaturo; e contengono una catena laterale acrilica piuttosto che propionica a C7; si presentano come acidi liberi non esterificati in fitolo. Un’altra varietà di Chl c è c3, che ha un’elevata polarità rispetto ai Chls c1 e c2. La clorofilla c è stata riportata in letteratura come più stabile rispetto alle clorofille a e b.

CLOROFILLA d_è presente solo nelle alghe rosse (Rhodophyta). Un gruppo che contiene Clorofilla a, e al massimo, solo tracce di clorofilla b. La clorofilla d, differisce notevolmente da tutte le altre clorofille in quanto ha uno spettro di assorbimento nel vicino infrarosso;  in vivo è tra 708 e 720 nm.

CLOROFILLA f_ è la clorofilla più recentemente descritta; nel 2010  è stata è stata isolata da stromatoliti della specie Halomicronema hongdechloris, il cianobattere filamentoso più sottile conosciuto fino ad oggi che contiene solo clorofilla a, e la Clorofilla f. La clorofilla f ha dimostrato di avere un picco di assorbimento a circa 706 nm e una massima emissione di fluorescenza a 722 nm a temperatura ambiente e in metanolo, rendendola la clorofilla più spostata verso il  rosso scoperta fino ad oggi. Le funzioni fotofisiche e fotochimiche del tipo f sono ancora scarsamente noto e sono ora oggetto di indagine.

 

STRUTTURA

Nel 1938 A.Stoll ed A.Wiedemann riuscirono per la prima volta ad estrarre dalle piante un prodotto che chiamarono cloroplastina, formato da complessi proteina/clorofilla nel quale la clorofilla risultava molto somigliante alla molecola per come è presente nelle membrane tilacoidali dei tessuti fotosinteticiLa cloroplastina presentava lo stesso spettro di assorbimento e la stessa resistenza alla luce della clorofilla in vivo, e le molecole di clorofilla rappresentavano il gruppo prostetico (non proteico) di un cromoprotide (sostanza proteica colorata), formato da più molecole di clorofilla. Questa scoperta rappresentò un vero progresso nello studio della costituzione della clorofilla per come è in natura. Per quanto riguarda invece, la struttura delle singole molecole clorofilliane, è nel 1978 che venne resa nota la loro stereochimica per come la si conosce ancora  oggi.

Le clorofille sono definite tetrapirroli ciclici, in cui i quattro anelli pirrolici, uno in forma ridotta (pirrolina), sono legati assieme da quattro legami metinici (=CH-), e i quattro atomi di azoto sono coordinati con un atomo di Magnesio centrale. La struttura è simile a quella del gruppo eme che al posto di un atomo di Magnesio ha un atomo di Ferro. Un quinto anello isociclico, l’anello E (ciclopentanone), si trova vicino al terzo anello della pirrolina. Attorno all’anello E sono legati i diversi gruppi funzionali, specifici per le diverse clorofille che conferiscono proprietà specifiche alla molecola. La clorofilla viene  biosintetizzata attraverso lo stesso processo metabolico delle porfirine come l’eme alle quali è strutturalmente simile, ma non uguale, infatti la clorofilla nonostante mostra ancora sistemi coniugati estesi di doppi legami carbonio-carbonio è una diidroporfirina (porfirina ridotta). Al quarto anello, è legata una lunga catena laterale terpenica di natura  idrofobica  (il resto della molecola è idrofilo) che permette l’ancoraggio della clorofilla alle membrane dei tilacoidi, chiamata fitolo.

La molecola di clorofilla è relativamente grande; la testa di porfirina è di circa 1,5 x 1,5 nm, mentre la lunga catena di fitolo  è complessivamente lunga circa 2 nm.

La clorofilla a e la clorofilla b, strutturalmente differiscono solo per il costituente della catena laterale sul carbonio 7, che nel tipo a è un gruppo metilico (−CH3), mentre nel tipo b da gruppo formilico (–CHO).

In natura il loro rapporto è generalmente di 3 a 1, e costituisce un parametro dello stato fisiologico della pianta. Il rapporto tra le due clorofille varia a seconda delle condizioni di crescita e dei fattori ambientali. Per esempio, le specie vegetali esposte al sole tendono ad avere un rapporto più elevato (da 3,2 a 4) rispetto alle piante ombra (da 2,6 a 3,2). L’aumento della percentuale di clorofilla b nelle piante ombra è dovuto alle sue diverse proprietà di assorbimento rispetto alla clorofilla a, infatti la piccola differenza a livello strutturale delle due, altera di fatto la disposizione della nube di elettroni delocalizzati, permettendo alla b di catturare meglio la luce a bassa intensità, rispetto a quanto riesca a fare la clorofilla a, così da colmare parzialmente lo spazio di spettro della clorofilla a.

I PIGMENTI della FOTOSINTESI

Le clorofille sono di colore verde perché assorbono fortemente nelle regioni rosse e blu dello spettro visibile. Le piccole differenze nelle strutture delle due clorofille producono dei picchi massimi della clorofilla b spostati verso la regione verde dello spettro. Lo spettro di assorbanza delle clorofille mostra due picchi caratteristici:

–  la clorofilla a, è a 432nm e a 669nm,

–  la clorofilla b, è a 455nm e a 644nm.

Ogni parte strutturale delle clorofille, risulta avere una sua ragione  funzionale per la fotosintesi clorofilliana:

–  Il carattere lipofilo del fitolo, è un fattore importante per le interazioni con le catene peptidiche delle proteine, questo a livello pratico permette alle clorofille di legarsi e orientarsi correttamente  sulla superficie della membrana tilacoidale dove le proteine sono inserite

–  I 10 doppi legami coniugati alternati a legami semplici e l’estesa struttura ad anello, permette la formazione di una serie di elettroni delocalizzati su tre anelli, dando numerosi stati di riduzione di ossidazione che sono importanti sia per l’assorbimento della luce, che per il trasferimento di energia da una molecola all’altra.

–  La presenza di un atomo di Magnesio nella clorofilla è fondamentale per la fotosintesi. La struttura elettronica del Mg gli consente di cambiare la distribuzione elettronica dell’anello di porfirina per produrre potenti stati eccitati.

–  La differenza strutturale tra clorofilla a e b, che genera diversi ma complementari spettri di assorbimento rispetto alla luce solare incidente; la luce non assorbita dalla clorofilla a, viene catturata dalla clorofilla b

I pigmenti fotosintetici hanno il compito di catturare più luce possibile, e per questo oltre alle differenze strutturali delle clorofille a e b è altrettanto importante la presenza dei PIGMENTI ACCESSORI (xantofille e betacaroteni) che coprono una regione (tra 500 e 600 nm) nella quale l’assorbimento da parte di entrambe le clorofille è relativamente debole; infatti i carotenoidi assicurano l’assorbimento della luce in ambiti spettrali non adeguatamente coperti dalle clorofille.

La più abbondante delle xantofille presenti nei pigmenti antenna è la luteina che costituisce più del 40% dei carotenoidi presenti nei fotosistemi. Degni di nota sono anche le xantofille neoxantina, violaxantina, e anteroxantina; dove quest’ultime due sono coinvolte nel cosiddetto ciclo di disattivazione dell’energia luminosa (meccanismo protettivo nei confronti del sistema).

DEGRADAZIONE

La degradazione e la scomparsa della clorofilla in natura, può avvenire per varie cause oltre a dipendere da specie a specie:

⊃ grado di maturazione;

⊃ normale turnover dei tessuti vegetali;

⊃ senescenza fogliare.

A seconda dei casi segue reazioni e processi diversi non tutti ancora chiariti, ma in tutti i casi è sempre indicativo di un rallentamento della fotosintesi, causata spesso dall’interruzione dell’attività del cloroplasto.

Anche in natura, i vegetali hanno un loro ciclo vitale. e nei tessuti vegetali integri la clorofilla è comunque soggetta a un ricambio naturale, che comporta la sua degradazione e la sua sintesi in modo simultaneo e in un processo continuo che probabilmente perdura per tutta la vita della pianta, o almeno fino alla fase di senescenza fogliare o nel caso dei frutti fino alla loro maturazione. Nella loro senescenza (piante) e la loro maturazione (frutti) vi è una forte diminuzione del contenuto di clorofilla, causata del processo biochimico naturale di scomposizione della clorofilla, che ne garantisce la completa trasformazione in cataboliti incolori, o a favore di altri pigmenti.

A volte il metabolismo della clorofilla è molto visibile dal colore delle foglie, per esempio durante i cambiamenti stagionali, come in autunno quando via via che le clorofille si degradano, e l’emergere del colore dei pigmenti ausiliari,  carotenoidi e in alcune piante anche antociani, le foglie sono gialle, rosse o marroni.

Oltre a questo, la clorofilla, fuori dal suo ambiente naturale protetto, si degrada molto facilmente. Diverse reazioni chimiche ed enzimatiche possono causare la degradazione della clorofilla, oltre alla degradazione naturale, anche la conservazione e la lavorazione a caldo degli alimenti possono causare importanti cambiamenti di colore.

Come per la biosintesi della clorofilla anche per la sua degradazione il processo è molto elaborato, e sfortunatamente, molti passaggi intermedi, compreso l’ordine con cui la clorofilla viene trasformata da un pigmento verde stabile a un composto incolore, sono ancora da comprendere fino in fondo. Quello che è certo ed evidente è che la senescenza e la maturazione, sono processi che comportano una perdita netta di clorofilla, e sono accompagnati da profondi cambiamenti fisici dell’ambiente che circonda i pigmenti. Questi cambiamenti interessano i cloroplasti, ma più che altro le caratteristiche della loro membrana tilacoidale, dove l’alterazione della sua fluidità e la perossidazione delle sue proteine crea un ambiente ostile per le clorofille che, non più protette dagli attacchi dell’ossigeno attivo, vengono  foto ossidate e degradate totalmente.

Le clorofille nella fase di senescenza dei vegetali, presentano gli stessi comportamenti che hanno quando i vegetali vengono raccolti o quando vengono estratte e isolate, dove soprattutto in presenza di ossigeno, risultano molto sensibili alla luce, tanto da venire degradate irreversibilmente. La degradazione della clorofilla può verificarsi entro poche ore o in diverse settimane. Nel tessuto vegetale, la clorofilla viene rilasciata dal suo complesso proteico seguita dall’eliminazione del fitolo. Questo processo degradativo è osservato anche negli alimenti per effetto della lavorazione e il tipo di prodotto dipende dalla gravità del trattamento. La degradazione procede per ossidazione della struttura dell’anello a cloro e, infine, per formazione di prodotti finali incolori. La luce abbinata alla presenza di ossigeno, è uno dei fattori più importanti per la degradazione  delle clorofille separate dal loro ambiente naturale e non più protette dall’azione antiossidante dei carotenoidi endogeni delle piante in vivo. L’interruzione delle cellule e dei tessuti vegetali e la denaturazione delle proteine attaccate alle molecole di clorofilla, sono i motivi principali per i quali, nei vegetali dopo il raccolto, o negli estratti, la clorofilla si dimostra una molecola molto labile ed estremamente sensibile ai cambiamenti sia fisici che chimici.

Diversi sono i fattori che possono causare la degradazione della clorofilla, ma spesso questi cambiamenti sono associati all’attività enzimatica; quindi nei vegetali dopo il raccolto, l’inattivazione delle attività enzimatiche è considerata essenziale. La sbollentatura è un trattamento termico molto comune per inattivare gli enzimi che catalizzano le reazioni di degradazione durante la conservazione. L’attività degli enzimi endogeni ancora attivi, innescano la degradazione della clorofilla, producendo anche in breve tempo rapidi derivati che ne modificano il colore; la clorofillasi catalizza l’idrolisi del fitolo dall’anello porfirina, formando clorofillidi. La magnesio dechelatasi catalizza la rimozione dello ione Mg2+ dall’anello tetrapirrolico, che porta alla formazione di feofitine e feoforbidi. Gli enzimi ossidativi come le lipossigenasi, la clorofilla ossidasi e perossidasi contribuiscono alla perdita di colore verde e all’accumulo di cataboliti ossidati di clorofilla.

Il processo di degradazione delle clorofille,  indipendentemente dal fatto che coinvolga clorofille in vivo, clorofille nei vegetali raccolti, o che sia per senescenza o per condizioni non favorevoli, sembra che presenti intermedi comuni e si possa dividere in due fasi:

Fase 1 _in questa fase, le reazioni sono catalizzate da enzimi come la clorofillasi e magnesio dechelatasi, o da trattamenti termici più o meno lievi che producono: clorofillidi, feofitine e feoforbidi. Dove tutti i derivati indistintamente, presentano ancora due caratteristiche comuni, un’anello di tetrapirrolo intatto, e  una colorazione, anche se con differenze di tonalità anche evidenti tra loro (dal verde brillante, al verde giallo fino al bruno).

Fase 2_nei  passaggi successivi, più avanzati, gli enzimi che intervengono sono di tipo ossidativo come la lipossigenasi, la clorofilla ossidasi e perossidasi, e trattamenti termici o condizioni sfavorevoli più aggressivi (pH acidi, luce). In questa fase si nota la formazione di diversi composti (tetrapirroli lineari) non del tutto chiariti, dove tutti hanno in comune la rottura dell’anello del tetrapirrolo, che di fatto modifica le caratteristiche cromatiche delle molecole tanto che  questi composti sono  tutti “incolori”. Enzimi ossidativi come lipossigenasi, clorofilla ossidasi e perossidasi contribuiscono alla perdita di colore verde e all’accumulo di cataboliti ossidati di clorofilla.

La conservazione del colore verde brillante di frutta/verdura durante la lavorazione a caldo è stata una delle principali preoccupazioni dei trasformatori e di importanza economica per l’industria alimentare, perché è ben noto che la preferenza dei consumatori si sposta verso prodotti con colori brillanti. Diverse metodologie sono state utilizzate per preservare il colore verde di frutta e verdura. Le tecniche impiegate sono il controllo del pH, l’uso di sali, il controllo del trattamento termico, l’uso di atmosfere modificate e combinazioni di questi. La conservazione dell’atomo di Mg nella struttura della clorofilla è importante per la qualità del colore dei vegetali verdi.

DERIVATI DELLE CLOROFILLE

Clofofillide

(tonalità verde brillante)

Nella biosintesi, i  clorofillidi corrispondono allo step precedente della clorofilla, dove la molecola non è ancora legata alla catena di fitolo. Il non legame con la catena terpenica, rende i clorofillidi composti più polari, quindi più solubili in acqua rispetto alla clorofilla. I clorofillidi presentano la medesima colorazione della clorofilla, verde brillante, infatti la deesterificazione della catena del fitolo anche se modifica la solubilità della molecola, non ha nessuna influenza sulle sue caratteristiche cromatiche. La loro stabilità si è dimostrata  essere leggermente maggiore rispetto alle molecola di clorofilla. In vitro, si ottengono con l’idrolisi della clorofilla (a/b) sia in condizioni di lieve acidità e alcalinità, che per via enzimatica, mentre in natura, in alcune specie vegetali (non in tutte) la trasformazione della clorofilla in clorofillide viene catalizzata dall’enzima clorofillasi. La clorofilla in questo modo viene convertita nella sua forma relativamente più solubile in acqua così da essere più agevolmente trasportata fuori dal cloroplasto verso il vacuolo. Nella degradazione delle piante superiori, la clorofilla b, scompare insieme alla clorofilla a, anche se i prodotti di degradazione sembrerebbero interamente derivati dalla clorofilla a. Questo induce a pensare che la clorofilla b, possa o essere convertita enzimaticamente in clorofillide b e poi in clorofillide a, prima di proseguire nella sua ulteriore degradazione, o presentare cataboliti identici alla clorofilla di tipo a.

Feofitine

(tonalità verde oliva)

 

Le feofitine sono i derivati senza magnesio delle clorofille, dove l’atomo di Mg centrale è sostituito da due atomi di idrogeno. La trasformazione delle clorofille in feofitine è un processo semplice; gli acidi deboli sono sufficienti per indurre la perdita dell’atomo di magnesio dall’anello porfirinico e la sua sostituzione con l’idrogeno.   La feofitina si forma naturalmente durante la senescenza fogliare o durante la decomposizione del vegetale, tramite l’azione dell’enzima Mg-chetasi, mentre nei vegetali raccolti la sua formazione viene accelerata dai processi termici anche lievi o dall’azione di acidi deboli. La loro tonalità è verde oliva, sicuramente meno brillante rispetto ai clorofillidi e alla clorofilla. Fino al 1977, si credeva che la feofitina fosse solo un sottoprodotto della degradazione della clorofilla, ma poi alcuni scienziati dimostrarono, non senza forti opposizioni, che nella fase luminosa della fotosintesi, era la feofitina a, e non il Plastochinone, ad essere la molecola che fungeva da accettore primario di elettroni nel fotosistema II. La teoria fu ulteriormente convalidata da prove che dimostrarono che: la fotoriduzione della feofitina veniva osservata in miscele contenenti centri di reazione PSII e che la quantità di feofitina era direttamente proporzionale al numero dei centri di reazione PSII. A quel punto si riconobbe senza ombra di dubbio che la feofitina a, è l’accettore primario di elettroni coinvolto nella catena di trasporto degli elettroni nelle reazioni luce-dipendenti della fotosintesi posizionato tra P680 e il plastochinone. Dopo che nel centro di reazione P680, è avvenuta l’ossidazione della molecole di clorofilla a , gli elettroni vengono trasferiti alla feofitina che prima si riduce e successivamente si ossida cedendo elettroni al plastochinone.

Feoforbide

(tonalità bruna)

Se partendo dalla clorofilla, con la rimozione dell’atomo centrale di Mg si ottiene la feofitina, partendo da un clorofillide, si ottiene un feoforbide.

La Clorofilla  senza Mg   è chiamata   feofitina.

Un clorofillide senza Mg  è chiamato   feoforbide

 

I feoforbidi sono clorofillidi (clorofille senza fitolo) che hanno perso anche il magnesio centrale. In vivo, nella fase di senescenza la trasformazione dei clorofillidi in feoforbidi è catalizzata (come avviene per le feofitine) dall’enzima Mg-chetasi, quindi rappresenta lo step degradativo successivo ai clorofillidi. In vitro possono essere preparati a partire o da clorofille trattate con acido concentrato (HCI 30%) o da clorofillidi acidificate.

 

Piroclorofille

I piroderivativi delle clorofille o dei loro derivati sono i composti che hanno perso il gruppo carbometossi – COOCH3 a C-10 dell’anello isociclico, il gruppo è stato sostituito dall’idrogeno. La perdita del gruppo carbossimetossi a C13 (decarbometossilazione), necessita di temperature molto alte (100°C), vi è la produzione di piroderivati

Tutti gli enzimi coinvolti nel processo catabolico sembrano essere già stati identificati, anche se ora la sfida consiste nell’individuare il sistema che regola questo processo di degradazione.  La conoscenza dei meccanismi di degradazione e dei processi correlati sarebbe potenzialmente molto utile per l’industria alimentare, controllando lo stato di degradazione della clorofilla si potrebbero evitare i tanti limiti applicativi delle clorofille naturali.

ESTRAZIONE DELLA CLOROFILLA

Il processo di estrazione della clorofilla deve essere effettuato rapidamente e in penombra per prevenire reazioni di degradazione come il fotosbiancamento e/o l’allomerizzazione. Acetone, metanolo, etanolo e solventi clorurati, tra gli altri, sono utilizzati come veicoli di estrazione. In particolare, è stato raccomandato l’uso di soluzioni acquose di acetone, dove la proporzione di acqua non deve superare il 10%. La filtrazione o la centrifugazione viene utilizzata per rimuovere i solidi dal solvente. Dopo l’eliminazione del solvente, la resa di estrazione è di circa il 20% in cui sono incluse clorofille, feofitine e altri prodotti di degradazione.

Con alcuni materiali vegetali si consiglia un rapido riscaldamento in acqua bollente seguito da un raffreddamento immediato; questa procedura migliora l’estraibilità e la stabilità attraverso la riduzione dell’ossidazione e degli enzimi idrolitici. Per evitare l’effetto di condizioni acide, è comune l’aggiunta di CaCO3, MgCO3, NaHCO3, Na2CO3 L’estratto corrispondente viene ulteriormente elaborato per ottenere preparati solubili in acqua o olio. Se un estratto secco viene risospeso in un solvente immiscibile in acqua, si ottiene un prodotto solubile in olio; con questa procedura si possono ottenere feofitine prive di metalli se viene effettuata in condizioni acide o feofitine di rame se il processo viene effettuato in condizioni acide e in presenza di sali di rame. D’altra parte, un residuo essiccato può essere saponificato, dove i gruppi  metile e fitolo vengono sostituiti con sodio o potassio e si ottengono composti solubili in acqua (clorofilline).

ISOLAMENTO

L’estrazione può essere effettuata con acetone seguita da due fasi di precipitazione utilizzando miscele di diossano/acqua per ottenere clorofille parzialmente purificate. La miscela viene poi frazionata mediante cromatografia per separare, in primo luogo, le clorofille dai carotenoidi; in una seconda fase utilizzando lo stesso adsorbente, la clorofilla a viene separata dalla clorofilla b. Gli estratti di clorofilla hanno una buona purezza e si raccomanda l’uso di temperature fredde per prevenire la formazione di isomeri C-10.

MATERIA PRIMA

Fino ad oggi, la maggior parte, se non tutte, le clorofille che entrano nel mercato dei coloranti alimentari derivano dalle piante terrestri (quindi le clorofille sono del tipo a e b) come erba, erba medica (Medicago sativa) e ortiche (Urtica dioica).La scelta della materia prima dovrebbe tenere conto del suo alto rendimento produttivo, del suo contenuto di clorofilla, della sua disponibilità e della convenienza della raccolta e dell’essiccazione.

Alfa Alfa

Ortiche

Sebbene i coloranti di clorofilla e clorofillina sembrino essere facili da ottenere, in pratica la loro instabilità rende la loro lavorazione piuttosto difficile, e delicata. Tradizionalmente, viene utilizzato materiale essiccato o in polvere dove con i  moderni metodi le temperature di essiccazione sono strettamente controllate e rese efficaci anche per disattivare gli enzimi endogeni. (clorofillasi e Mg-chetasi) che potrebbero danneggiare la materia prima durante lo stoccaggio. Come tutti  i  coloranti alimentari  anche le clorofille e le clorofilline sono associate ad un numero E. e sono regolamentate in Europa dal Regolamento 1333/2008 che ne detta le modalità del loro uso, ma per quanto riguarda la loro produzione, è necessario che rispettino gli attuali requisiti di purezza, che prevede anche un uso limitato di solventi di estrazione.

LA PERCEZIONE DEL COLORE VERDE

Il colore verde, nelle sue varie tonalità è il colore più presente in natura ed è forse anche per questo motivo che in un modo o nell’altro, è il colore che ci condiziona di più. La nostra associazione al verde dei vegetali, è intuitivamente legata a parametri come la freschezza dei prodotti, e la sua valutazione risulta essere un criterio molto importante come indicatore di qualità per i consumatori. Per alcune verdure e per quasi tutta la frutta, il colore verde lo si usa anche per valutare il loro grado di maturazione, ma se in quest’ultimo caso, il colore non è quasi mai fuorviante, spesso lo è come unico indicatore della sua qualità. Purtroppo, nonostante nel loro ambiente biologico, le clorofille abbiano una buona stabilità, grazie soprattutto alla struttura che li circonda e ai pigmenti ausiliari (carotenoidi) nei vegetali dopo il raccolto, tendono a degradarsi molto velocemente, soprattutto nei vegetali trasformati, anche solo tramite interventi meccanici come il taglio.

Le colorazioni delle clorofille degradate, risultano spesso poco attraenti per il consumatore, nonostante la loro qualità in termini di valori nutrizionali e di freschezza possano essere ancora a livelli ottimali.

Questo fattore, risulta molto limitante per l’industria alimentare e spesso rende necessaria l’aggiunta di additivi coloranti, per riportarli al colore del vegetale appena raccolto e ripristinare la loro naturale attrattiva. Le clorofille naturali sono considerate sicure a causa della loro lunga storia di consumo umano come componenti di tutte le verdure verdi.

Le verdure verdi contenenti clorofilla potrebbero essere aggiunte direttamente agli alimenti come ingredienti con proprietà coloranti secondarie, ne è un esempio la farina di spinaci ad alta pigmentazione; tuttavia sono veramente poche le possibilità applicative, perché la scarsa stabilità delle clorofille durante la lavorazione e lo stoccaggio degli alimenti, soprattutto in presenza di acqua, la rende tutt’ora una strada impraticabile.

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