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Tra il 1883 e il 1885, lo scienziato svedese Hammersten (1883) dimostrò che le proteine del latte potevano essere divise in due gruppi, proteine della caseina e proteine del siero (siero di latte), regolando il pH del latte bovino al punto isoelettrico (pI) delle caseine (pH 4,6). A questo pH, le proteine della caseina precipitano dal latte mentre la frazione proteica del siero di latte rimane solubile.
Più tardi, ulteriori studi hanno stabilito che entrambe le frazioni di caseina e proteine del siero di latte sono a loro volta composte da un numero di proteine diverse. Le concentrazioni di queste due frazioni nel latte di una particolare specie di mammiferi differiscono di nuovo, e si presume che siano adattate alle esigenze nutrizionali e fisiologiche dei giovani della specie. Il rapporto proteine del siero di latte/caseina del latte bovino è 20:80.
Le frazioni di caseina e proteine del siero di latte possono essere separate l’una dall’altra facendo precipitare la caseina dalla soluzione e lasciando le proteine del siero di latte in soluzione. La precipitazione della caseina può essere ottenuta o regolando il pH vicino al punto isoelettrico (∼4,6) delle caseine o aggiungendo un enzima chiamato caglio che scinde la frazione idrofila della caseina che è normalmente responsabile della stabilizzazione delle micelle di caseina. Con la precipitazione isoelettrica, le frazioni separate vengono chiamate “caseina acida” e “siero di latte acido”, mentre se si utilizza la precipitazione enzimatica le frazioni separate sono chiamate “caseina presamica” e “siero di latte dolce”. Le frazioni separate utilizzando questi due processi hanno composizioni diverse e quindi gli ingredienti prodotti da essi possono avere proprietà funzionali diverse. La formazione della cagliata è un passaggio fondamentale nella creazione del formaggio e ci sono grandi quantità di siero di latte rimanenti da questo processo che possono essere utilizzate per produrre ingredienti funzionali di proteine del siero di latte.
IL LATTE
Le caseine sono definite come proteine del latte che precipitano dal latte scremato crudo quando il pH è regolato a pH 4,6 (cioè al pI della caseina) a temperature superiori a 10°C. A temperature inferiori a 10°C, si verifica l’aggregazione delle caseine, ma gli aggregati sono abbastanza fini da rimanere in sospensione.
FRAZIONAMENTO ED ETEROGENEITÀ DELLE CASEINE
La natura eterogenea delle caseine è stata descritta per la prima volta da Linderstrøm-Lang (1925) che ha frazionato la caseina isoelettrica/acida utilizzando un processo di estrazione con un acido etanolo-cloridrico (EtOH-HCl). Le quattro proteine che sono state identificate dalla caseina isoelettrica sono: αs1–, αs2–, β- e Ƙ-caseina, che rappresentano rispettivamente il 38%, il 10%, il 35% e il 15% della caseina totale.
Si verificano variazioni tra diverse proteine della caseina come il peso molecolare (MW) e le differenze nel profilo AA. Variazioni più sottili (ad esempio singole sostituzioni AA) possono verificarsi in ciascuna delle singole proteine producendo anche forme diverse della stessa proteina, che è chiamata micro-eterogeneità. Tutte le caseine sono fosforilate, cioè hanno gruppi fosfato attaccati a catene laterali di serina, treonnina e tirosina, mentre la caseina αs1, αs2, sono più altamente fosforilate rispetto alla caseina β- e Ƙ (tipicamente 8, 11, 5 e 1 gruppi fosfato, rispettivamente. Il grado o la fosforilazione di ciascuna proteina caseina è comunemente inclusa nel nome abbreviato della proteina caseina, ad esempio αs1-8P, αs2-11P, β-5P e Ƙ -1P. Inoltre, la Ƙ -caseina è una proteina glicosilata, il che significa che le frazioni di carboidrati (ad esempio, acido N-acetilneuraminico, galattosio e N-acetilgalattosamina) sono attaccate all’estremità C-terminale della molecola di Ƙ-caseina. L’entità della glicosilazione della Ƙ -caseina che si verifica può variare; su ogni proteina Ƙ-caseina possono essere presenti da 0 a 4 glicosidi, e questo produce 9 diverse possibili forme molecolari di Ƙ-caseina.
STRUTTURA E STABILITA’ TERMICA
Le caseine sono molecole relativamente piccole (MW che vanno da 19 a 25 kDa) che mancano di alti livelli di strutture proteiche secondarie o terziarie. Ciò è in qualche modo dovuto alle alte concentrazioni dell’amminoacido prolina nelle proteine: 17, 10, 35 e 20 residui di prolina sono presenti rispettivamente in αs1–, αs2–, β- e Ƙ-caseina. La prolina inibisce la formazione di α-eliche e la β gira a causa della presenza di un’ammina ciclica nella sua catena laterale. Poiché le strutture secondarie e terziarie non sono prevalenti nell’analisi strutturale delle caseine, si ritiene che abbiano una struttura non ordinata e aperta. La denaturazione della proteina si verifica quando una proteina perde la sua struttura secondaria o terziaria nativa, influenzando fortemente la funzionalità biologica e tecnologica di quella proteina. Poiché le caseine hanno un basso livello di struttura secondaria o terziaria, i trattamenti ad alta temperatura hanno scarso effetto sulle caseine, come evidenziato dal fatto che il latte bovino può essere riscaldato a 140°C per 20-30 minuti senza gelificazione. Tali trattamenti termici elevati, tuttavia, avranno altri effetti sulle caseine, come la defosforilazione degli amminoacidi.
IDROFOBICITÀ E SENSIBILITÀ AL CALCIO
Tutte le proteine della caseina hanno un’alta concentrazione (35-45%) di amminoacidi idrofobici come valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina e prolina. Nelle proteine strutturate, gli AA idrofobici sono generalmente sepolti all’interno della struttura terziaria della proteina; tuttavia, poiché le caseine hanno una struttura aperta e non ordinata, queste AA rimangono esposte, il che porta a considerare le caseine come aventi un’elevata idrofobicità superficiale. I legami idrofobici si formano facilmente tra le regioni idrofobiche delle caseine portando le caseine ad avere una forte tendenza ad auto-associarsi. Gli amminoacidi idrofobici sono associati all’amarezza, il che significa che l’idrolisi delle molecole di caseina ha il potenziale di produrre idrolizzati amari, il che è problematico in alcune applicazioni come la produzione di formaggio. Le caseine possono agire come molecole anfipatiche che assorbono prontamente le interfacce aria-acqua e olio-acqua al fine di ridurre la tensione interfacciale, stabilizzando così emulsioni e schiume. Tutte le caseine (ad eccezione della k-caseina) sono insolubili in presenza di calcio, naturalmente presente ad alte concentrazioni nel latte bovino; questo ci porterebbe a pensare che le caseine precipitino dal latte a causa di queste caratteristiche. In realtà questo non si verifica, proprio perché la Ƙ-caseina, che è solubile e insensibile a tutte le concentrazioni di Calcio, funge da agente stabilizzante per le altre caseine sensibili e insolubili in presenza del Calcio. La Ƙ-caseina combinandosi con tutte le caseine, forma grandi strutture colloidali chiamate micelle di caseina. Sebbene la Ƙ-caseina rappresenti solo il 15% delle caseine totali del latte, può stabilizzare fino a 10 volte il proprio peso di caseine Ca-sensibili attraverso la formazione della micella della caseina.
MICELLE di CASEINA
Nel loro stato naturale, le caseine tendono ad esistere come complessi cluster molecolari chiamati “micelle”che sono in parte tenute insieme da ioni minerali (come il fosfato di calcio). Negli ingredienti commerciali, le caseine possono anche essere presenti in un certo numero di altri tipi di cluster molecolari a seconda del modo in cui le proteine sono state isolate, ad esempio caseinato di sodio, caseinato di calcio, caseina acida e caseina presamica.
La struttura della micella della caseina è stata ampiamente dibattuta negli ultimi anni ed è ormai ampiamente accettato che siano grandi, sferiche (diametro tra 50 e 250 nm) e altamente idratate (3,5 kg di H2O per kg di proteine) e che contengano 70.000 singole molecole proteiche. La sostanza secca della micella della caseina è composta per il 94% da proteine e per il 6% da specie a basso peso molecolare, indicate come fosfato di calcio colloidale (CCP). Questo CCP è composto principalmente da Calcio e Fosforo con piccole quantità di magnesio, citrato e altre specie. La struttura superficiale esterna delle micelle di caseina è ricca di Ƙ-caseina che stabilizza la struttura micellare e la proteggere dalla destabilizzazione o dall’aggregazione con altre micelle di caseina. Il terminale C glicosilato, idrofilo della molecola di Ƙ-caseina (chiamato macropeptide) può essere trovato sporgente 7 nm dalla micella della caseina nella fase acquosa del latte. Questo crea uno strato peloso di k-caseina che circonda la micella della caseina, responsabile della stabilizzazione micellare attraverso la repulsione sterica ed elettrostatica. Se questo sembra ormai generalmente accettato, è la disposizione della caseina αs, della β caseina e del CCP all’interno della struttura interna della micella della caseina che ha prodotto il maggior dibattito nei vari modelli proposti negli ultimi anni.
Il modello più semplice fu proposto inizialmente da Waugh e Von Hippel (1956) e suggerì che le caseine αs e β fossero circondate da uno strato di Ƙ-caseina. Nel tempo, sono stati sviluppati altri due modelli principali che dettagliano la struttura interna della micella della caseina: il modello della submicella e il modello del nanocluster.
MODELLO SUBMICELLA
Il modello di submicella, proposto per la prima volta da Schmidt (1982) suggerisce che la micella di caseina è composta da submicelle più piccole fuse insieme dal CCP. Questo modello non ha riscontrato un largo sostegno in quanto si basa sull’ipotesi che ci siano due forme di unità di submicelle presenti in una micella di caseina – una submicella ricca di Ƙ-caseina e una submicella impoverita di Ƙ-caseina. Le submicelle ricche di Ƙ-caseina si trovano sulla superficie della micella, mentre le sottomicelle impoverite di Ƙ-caseina sarebbero nella struttura interna della micella di caseina. La ricerca non ha mai confermato che queste diverse submicelle esistano effettivamente.
MODELLO DEI NANOCLUSTER
Il modello dei nanocluster, introdotto da Holt (1992, 1998), descrive la struttura interna delle micelle di caseina come una rete aggrovigliata di caseine α e β collegate da interazioni idrofobiche. Questa rete di caseina contiene nanocluster di CCP (raggio di 2,3 nm) che agiscono stabilizzando la struttura del nastro di caseina.
Più recente è la presentazione di Dalgleish (1998, 2011) con un modello di nanocluster aggiornato che incorpora grandi pori all’interno della micella della caseina e una distribuzione più sparsa di Ƙ-caseina sulla superficie della micella. Questi pori sono abbastanza grandi da consentire:
⊃ un facile accesso alla K-caseina sporgente per gli enzimi proteolitici (importanti per la digeribilità e la destabilizzazione delle caseine)
⊃ movimento di singole proteine dentro e fuori la struttura della micella della caseina (per esempio β-caseina che esce e rientra nella micella per riscaldamento e raffreddamento).
Sia i modelli submicelle che nanocluster mantengono la caratteristica chiave che CCP, situato all’interno della micella della caseina, svolge un ruolo fondamentale nella stabilizzazione della caseina Ca-sensibile presente all’interno della micella della caseina.
Le proteine del siero di latte vengono tradizionalmente separate dalle caseine tramite precipitazione isoelettrica delle caseine regolando il pH del latte a 4,6. Un’altra pratica comune per la separazione del siero dalle caseine è attraverso l’aggiunta di un preparato enzimatico come il caglio (enzima primario chimosina) al latte, come si fa durante la produzione del formaggio, che provoca la destabilizzazione (scissione della Ƙ-caseina sulla superficie della micella), l’aggregazione e la precipitazione delle micelle di caseina (la cagliata), lasciando le proteine del siero di latte e il glicomacropeptide (GMP) (terminale C della Ƙ-caseina che viene scissa dalla chimosina) nella fase solubile. Il siero di latte prodotto attraverso la coagulazione enzimatica del latte è definito siero di latte dolce e contiene GMP. Nelle applicazioni industriali e di laboratorio, la separazione e l’ulteriore arricchimento delle proteine del siero di latte dalle caseine si ottengono abitualmente utilizzando operazioni unitarie come la cromatografia (ad esempio, cromatografia a scambio ionico), la filtrazione a membrana e la centrifugazione che sfruttano le differenze fisico-chimiche (come il peso molecolare e la carica) tra proteine del siero di latte e caseine per ottenere la separazione. La forma di siero di latte prodotta da queste operazioni è talvolta definita siero di latte tecnico.
Le principali proteine del siero di latte bovino sono:
Le proteine del siero di latte differiscono in termini di composizione di amminoacidi, dimensioni e proprietà fisico-chimiche (ad esempio, carica e idrofobicità superficiale);
STRUTTURA E STABILITA’ TERMICA
Le proteine del siero del latte sono altamente strutturate con alti livelli di struttura secondaria e terziaria.
La β-LG, che è la proteina del siero di latte predominante nel latte bovino, è altamente strutturata con più della metà della sua struttura esistente sotto forma di α-elica (15% della struttura β-LG) e β (50% della struttura β-LG) che formano una struttura globulare strettamente compatta, tenuta fortemente unita da ponti interni di disolfuro (S-S).
Questa struttura globulare altamente ordinata è comune per la maggior parte delle principali proteine del siero di latte. Le proteine del siero di latte sono molto labili dal punto di vista termico in quanto sono suscettibili alla perdita di struttura durante i trattamenti di lavorazione comuni nell’industria lattiero-casearia (ad esempio, trattamenti termici elevati e omogeneizzazione ad alta pressione). In caso di esposizione a temperature superiori a 65°C, le proteine del siero di latte tendono a dispiegarsi dalla loro struttura nativa, esponendo gli amminoacidi come la cisteina (che contiene un gruppo solfidrilico libero -SH). Il gruppo SH libero, è facilmente accessibile e altamente reattivo, il che permette ad altre proteine del siero del latte denaturate e ad altre proteine contenenti gruppi SH esposti (ad esempio, Ƙ-caseina) di interagire e aggregarsi attraverso la formazione di nuovi legami S-S.
CARICA E IDROFOBICITÀ
Le proteine del siero di latte contengono alti livelli di amminoacidi polari e carichi (vedi tabella). È stato riconosciuto che le proteine con alti livelli di AA polari e/o cariche, come le proteine del siero di latte, interagiscono fortemente con l’acqua a causa della loro natura altamente idrofila. Le proteine del siero del latte, a causa della loro natura idrofila, sono associate a buone caratteristiche di solubilità e le proteine negli isolati di proteine del siero del latte sono altamente solubili in un ampio intervallo di pH.
A causa della loro sensibilità al calore, la solubilità delle proteine del siero di latte dipende molto dalla temperatura, influenzata dalla denaturazione e dall’aggregazione. A causa della loro carica e natura idrofila, le proteine del siero di latte (a differenza delle caseine) mostrano una tendenza molto limitata ad auto-associarsi, sono meno sensibili alle variazioni di pH e alla forza ionica rispetto alle caseine.
SOLUBILITÀ
La solubilità di una proteina è definita come la quantità di proteina che si solubilizza o si disperde in condizioni specifiche (temperatura e forza ionica) e non sedimenta per forza centrifuga definita. La solubilità di una proteina è considerata la proprietà funzionale più importante in quanto è un prerequisito per molte altre proprietà funzionali e agisce come un utile indice di funzionalità proteica complessiva.
Se una proteina ha una buona solubilità, le sue potenziali applicazioni sono naturalmente espanse. La solubilità di una proteina è in definitiva decisa da una combinazione di (1) l’equilibrio delle interazioni idrofobiche ed elettrostatiche intermolecolari, che a loro volta sono controllate dall’idrofobicità superficiale e (2) lo stato (nativo o denaturato) della proteina in specifiche condizioni ambientali di temperatura, pH e forza ionica.
GELIFICAZIONE
La gelificazione, si riferisce alla capacità delle proteine di formare un gel in condizioni pratiche,
durante la lavorazione o la conservazione di un prodotto alimentare. E’ un attributo funzionale molto importante in molti sistemi alimentari, per esempio nella produzione di yogurt e formaggio. Un gel, è definito come un sistema contenente una proporzione relativamente piccola di solido in una proporzione relativamente grande di liquido; un gel proteico è composto da una rete tridimensionale di proteine che intrappolano una grande quantità di acqua, e si forma quando le molecole proteiche vengono denaturate. Queste alterazioni, consentono lo svilupparsi di regioni polipeptidiche in grado di interagire in vari modi (proteina-proteina e proteina-acqua), formando una rete tridimensionale e reticolata. Le alterazioni delle proteine del latte per formare un gel è normalmente ottenuta attraverso la denaturazione termica o la coagulazione enzimatica.
PROPRIETÀ ATTIVE DELLA SUPERFICIE
Le molecole con proprietà tensioattive sono una routine per stabilizzare emulsioni (olio disperso in acqua, O/W, o acqua dispersa in olio, W/O) e schiume (aria dispersa in fase liquida) nella lavorazione degli alimenti. Affinché le proteine agiscano come agenti attivi di superficie devono essere anfipatiche, il che significa che contengono sia regioni idrofile che idrofobiche. Le proteine del latte agiscono per ridurre la tensione interfacciale e superficiale tra le fasi idrofobica e idrofila, stabilizzando emulsioni e schiume.
Ingredienti funzionali a base di proteine del latte.
Latte intero in polvere (anche Bio), Latte intero in polvere Instant, Panna in Polvere 42%.
Caseinato di Sodio
Latte in polvere
Lattosio
Proteine del Latte
Sieri di Latte in polvere
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Latte in polvere
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Proteine del Latte
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